實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種以PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)的DNA定量技術(shù)，通過對目標(biāo)基因在擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的拷貝數(shù)進(jìn)行實時的定量，從而達(dá)到對目的基因的定性和定量分析?，F(xiàn)有兩種常用的方法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量：一種是利用熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合，通過熒光強(qiáng)度進(jìn)行熒光定量；另一種是利用攜帶了熒光報告基因的特異性DNA探針對目標(biāo)基因進(jìn)行定量。
常用熒光染料有：SYBR GreenⅠ、EvaGreen、LC Green等
Taqman熒光探針作為定量檢測的首選，是一種寡核苷酸，充當(dāng)DNA復(fù)制的起點(diǎn)，熒光基團(tuán)連接在探針的5'末端，淬滅劑連接在3'末端。PCR擴(kuò)增時加入引物和探針，探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，探針酶切降解，報告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分離，熒光信號被系統(tǒng)檢測接收，每擴(kuò)增一條DNA鏈伴隨一個熒光分子形成，實時熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物同步進(jìn)行，實現(xiàn)實時定量的實驗結(jié)果。相對于SYBR熒光染料具有序列特異性，直結(jié)合到互補(bǔ)區(qū)的強(qiáng)靈敏度。相較于雜交探針，其只需設(shè)計一條探針，既方便也能完成定量PCR要求。
獲得游離5，-羥基→合成DNA原料→帶帽（capping）反應(yīng)→轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定磷酸三酯→重復(fù)步驟4
探針引物設(shè)計實驗流程：
目的基因查找比對→探針與引物設(shè)計→合成
熒光定量QPCR實驗流程：
取材→RNA提取逆轉(zhuǎn)錄成cDNA→實時熒光定量PCR-(QPCR產(chǎn)物電泳)→數(shù)據(jù)分析
基因名稱和種屬、或已知探針引物序列、或基因ID號
熒光定量QPCR送樣運(yùn)輸要求：
組織、細(xì)胞：-80℃保存，干冰運(yùn)輸；
血液：EDTA抗凝管，4℃運(yùn)輸；
RNA樣本：體積≥10 μL，干冰運(yùn)輸。
