全面的基因組覆蓋范圍：檢測>853,307個CpG位點，全面覆蓋CpG島、啟動子、編碼區(qū)及增強子
高質(zhì)量的數(shù)據(jù)：沿用了450k芯片的Infinium技術(shù)，同時采用Infinium I及II探針設(shè)計，使檢測范圍最大化
分辨率高：單堿基分辨率，可以直接檢測到發(fā)生甲基化的準(zhǔn)確位點
可重復(fù)性高：自身技術(shù)重復(fù)間的相關(guān)性以及與450K相同探針間的相關(guān)性R2 >0.98
起始模板量低： 僅需 250ng，大大節(jié)約了樣品量
適用于FFPE樣品
樣本類型
動、植物組織、細(xì)胞等
每個樣品總量不少于2ug，最低濃度不低于50ng/ul，OD 260/280值應(yīng)在1.7～1.9 之間，
基因組完整、無降解、無RNA污染。
A：進(jìn)入亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，手動方案至少需要500 ng，自動化方案至少需要1000 ng。
A：這是一種雙色測定。對于基于Infinium I Assay設(shè)計的Infinium HumanMethyation27 BeadChip測定，摻入的顏色取決于被查詢的CpG基因座之前的堿基。這可以是綠色或紅色。Infinium HumanMethylation450 BeadChip測定包括Infinium I和Infinium II研究設(shè)計。在后一種情況下，從探針序列的3'末端（其是查詢堿基上游的一個堿基）的單個堿基延伸將導(dǎo)致紅色或綠色信號，這取決于查詢位點是否未甲基化或甲基化。
為了探索I期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）可利用的生物標(biāo)志物，本案例采用 Illumina 450K甲基化芯片對444例非小細(xì)胞肺癌樣本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了10000個甲基化差異位點?；谶@些位點進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類分析，可以將患者明顯區(qū)分為預(yù)后好壞兩類。
圖1. 非小細(xì)胞肺癌樣本的非監(jiān)督層次聚類分析
本案例利用Illumina 450K甲基化芯片研究了多發(fā)性硬化影響的腦組織與正常腦組織的DNA甲基化差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲基化差異細(xì)微，但是差異是普遍存在的并且具有可重復(fù)性。通過RNA-seq研究發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性硬化影響的腦組織相比正常腦組織，調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細(xì)胞存活的基因，如BCL2L2和NDRG1是高甲基化的并且基因表達(dá)水平較低；而與蛋白水解加工相關(guān)的基因，如LGMN和CTSZ則是低甲基化并且基因表達(dá)水平較高。這些結(jié)果表明基因甲基化程度的改變會影響腦組織對于損傷的敏感性。
圖2. mRNA表達(dá)水平與啟動子甲基化相關(guān)性分析
[1] Sandoval J, Mendez-Gonzalez J, Nadal E, et al. A Prognostic DNA Methylation Signature for Stage I Non–Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology, 2013; 31(32): 4140-4147.
[2] Huynh J, Garg P, Thin T, et al. Epigenome-wide differences in pathology-free regions of multiple sclerosis- affected brains. Nature neuroscience, 2014; 17(1): 121-130.
在全世界分范圍內(nèi)，每年因肝癌死亡的病例超過50萬人，是主要的因癌死亡病因之一。在過去的十年中，隨著影像學(xué)的進(jìn)步以及健康體檢的普及，越來越多的肝癌病人在患病早期被發(fā)現(xiàn)。但由于肝臟捐贈者的短缺，外科肝臟切除術(shù)仍然是治療早期肝癌病人的最主要方法。本研究建立了一種預(yù)測早期肝癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)的模型。
1. CpG位點選擇
研究者首先采用焦磷酸測序技術(shù)驗證了450k芯片數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性。通過分析66例病人的FFPE樣本和新鮮冷凍組織樣本發(fā)現(xiàn)，隨機選擇的兩個CpG位點甲基化水平呈現(xiàn)出高度的一致性。采用△β＞0.15，F(xiàn)DR＜0.01和p value＜0.01這一標(biāo)準(zhǔn)，過濾450K芯片結(jié)果，得到2550個差異CpG位點。隨后，研究者為了區(qū)分高風(fēng)險和低風(fēng)險的病人，采用LASSO和SVM-RFE算法分別得到了30個差異最顯著的CpG位點。
2. 探究可預(yù)測的標(biāo)簽
通過比較兩種算法得到的CpG位點，發(fā)現(xiàn)有14種是同時被鑒定出的，46種是不同的。通過分析46種不同CpG位點，把66例樣本分成復(fù)發(fā)和不復(fù)發(fā)兩個亞類。研究者隨后采用Cox回歸模型在訓(xùn)練組中進(jìn)一步縮小了E-HCC病人的甲基化檢測位點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cg20657849（SCAND3）, cg19406367（SGIP1）, 和 cg19931348（PI3）三個甲基化位點與E-HCC病人復(fù)發(fā)高度相關(guān)。
隨后研究者采用焦磷酸測序技術(shù)，分別在訓(xùn)練組和鑒定組中量化這一發(fā)現(xiàn)。為了更好的研究這三個CpG位點用來預(yù)測E-HCC復(fù)發(fā)的準(zhǔn)確性，在訓(xùn)練組中設(shè)定了一種危險系數(shù)評分。（risk score = (0.104 ×SGIP1甲基化水平) + (-1.125 ×SCAND3甲基化水平) + (-0.085 × PI3甲基化水平)）研究發(fā)現(xiàn)，-0.401為risk score閾值。
3. 證實這一標(biāo)簽
為了證實這一模型的穩(wěn)定性，研究者分別在一組內(nèi)部樣本和兩組外部樣本進(jìn)行了檢測。在內(nèi)部樣本中，該模型成功的分類了68例復(fù)發(fā)高風(fēng)險病人，73例低復(fù)發(fā)風(fēng)險病人。在外部樣本中，同樣成功分類了高風(fēng)險和低風(fēng)險病人。ROC分析發(fā)現(xiàn)，MSEH預(yù)測早期肝癌病人復(fù)發(fā)比三個CpG位點單獨檢測更有效。
4. 建立可預(yù)測的諾模圖
為了建立臨床上適用的用來預(yù)測個體復(fù)發(fā)的模型，綜合考慮了協(xié)變量后，研究者用諾模圖建立了可以用來預(yù)測的模型?；赗FS的多變量分析，研究者生成了一個諾模圖預(yù)測患者的5年生存率，通過三個校正點的檢測均得到理想結(jié)果。
本文通過分析早期肝癌患者甲基化芯片結(jié)果，得到三個與早期肝癌患者復(fù)發(fā)相關(guān)的CpG位點，并通過訓(xùn)練組和驗證組優(yōu)化了這一預(yù)測模式。最終，研究者建立了一種諾模圖，用來預(yù)測早期肝癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險。
案例四：甲基化研究揭示鼻咽癌治療新靶點
在中國華南地區(qū)，鼻咽癌有較高的發(fā)病率。目前，鼻咽癌病人的治療方案主要取決于病人的TNM分期。但是，約30%的鼻咽癌
甲基化高級分析A. 甲基化與表達(dá)譜相關(guān)性熱圖，此類型的圖也可展示其他不同組學(xué)的相關(guān)性。B. 基因組、轉(zhuǎn)錄組與甲基化組變異通路圖，可在同一張圖上展示通路中的基因組、轉(zhuǎn)錄組與甲基化組等不同組學(xué)上的變異，以及多組學(xué)的變異對通路的影響。C. 關(guān)鍵基因的多組學(xué)相關(guān)性圖，以相關(guān)性圖的形式，同時展示關(guān)鍵基因在基因組、轉(zhuǎn)錄組與甲基化等多組學(xué)層面上的相關(guān)性，共變異或甲基化狀態(tài)。
HYBRIDIZATION 雜交圖中橫軸是log2(信號值)，縱軸是樣本名稱。紅色熒光表示未甲基化位點的log2(信號值)，綠色熒光表示甲基化位點的log2(信號值)。結(jié)論：紅色熒光和綠色熒光的差值一般是2個數(shù)量級。陽性參照中綠色探針產(chǎn)生的log2(信號值) >12，標(biāo)記實驗成功。
樣本質(zhì)控圖橫軸是log2(甲基化中位數(shù)值), 縱軸是（非甲基化中位數(shù)值），每個樣本的整體甲基化程度一個圓點表示，其在虛線右上角分布則表示達(dá)到質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論: 本研究全部樣本達(dá)到質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)。
