背景簡(jiǎn)介
宏基因組測(cè)序（Metagenomics Sequencing）是對(duì)環(huán)境樣品中的微生物群落的基因組進(jìn)行高通量測(cè)序，主要研究微生物種群結(jié)構(gòu)、基因功能活性、微生物之間的相互協(xié)作關(guān)系以及微生物與環(huán)境之間的關(guān)系。宏基因組測(cè)序研究擺脫了微生物分離純培養(yǎng)的限制，擴(kuò)展了微生物資源的利用空間，為環(huán)境微生物群落的研究提供了有效工具。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
直接對(duì)特定環(huán)境中全部微生物群體基因組進(jìn)行測(cè)序。
環(huán)境微生物通常以群落方式共存和互作，宏基因組研究比單個(gè)個(gè)體研究更能反映微生物的真實(shí)生存狀態(tài)。
除分析微生物群體多樣性和豐度外，還可以解析微生物基因功能和參與的代謝通路，發(fā)掘新的具有特定功能的基因。
技術(shù)路線
分析內(nèi)容
樣本類型
環(huán)境樣品，總DNA等
建議總DNA起始量：5 μg，最低0.5 μg，濃度≥30 ng/μL（Qubit定量）
Q1：微生物群落研究方法比較？
A：16S rDNA測(cè)序：由于研究對(duì)象只為細(xì)菌的16S rDNA，因此16S測(cè)序技術(shù)更多只用于研究群落物種信息，也就是利用OTU物種分類、α和β多樣性分析等手段解答群落有什么物種，物種關(guān)系是什么等問(wèn)題。因此，這種技術(shù)更多地只能了解到環(huán)境對(duì)微生物的組成有何影響，更偏向于單向關(guān)系研究。
宏基因組測(cè)序：宏基因組的研究對(duì)象為群落所有DNA，因此研究范圍更廣。理論上不單只可以了解群落的組成和多樣性等物種信息，同時(shí)，利用基因的注釋信息，還可以挖掘群落的核心功能和通路信息，在基因組層面了解這個(gè)群落到底有什么物種，這些物種能夠發(fā)揮什么功能。只有了解群落功能，才能知道它們對(duì)環(huán)境有什么影響，這有利于進(jìn)行微生物與環(huán)境的雙向研究。
Q2：宏基因組測(cè)序原理？
A：將基因組DNA隨機(jī)打斷成若干條500bp左右的小片段（類似于拼圖中的單個(gè)形狀不一的模塊），然后連接接頭，在片段兩端加通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序。將reads進(jìn)行組裝拼接（類似于將眾多模塊拼成一副完整圖片），得到基因序列，眾多基因構(gòu)成完整的基因集。同時(shí)將獲得的reads片段或組裝好的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到物種注釋結(jié)果。
Q3：土壤樣本準(zhǔn)備注意事項(xiàng)？
A：取土壤表層樣品（0~20 cm ），除去石塊和植物殘根等雜物，放入無(wú)菌封口袋中，立即置于冰盒 （建議使用干冰，以利更好地保持微生物原貌）中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室 ，馬上進(jìn)行 DNA抽提。DNA 可置于 -20 ℃保存，長(zhǎng)期保存建議置于 -80℃存放。 如無(wú)法進(jìn)行DNA抽提，請(qǐng)盡快將樣本置于液氮中冷凍4小時(shí)以上，再轉(zhuǎn)移至-80℃保存 。
如采集根際土壤，拔取植株后，需抖落植株根部的大塊松散土壤，用已消毒的軟毛刷下附著在植物根際的土壤，放入無(wú)菌封口袋中，立即置于冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室 ，馬上進(jìn)行DNA抽提。
Q4：水體樣品準(zhǔn)備注意事項(xiàng)？
A：使用采水器采集水樣（建議1~2 L），置于冰盒（建議使用干冰，以利更好地保持微生物原貌）中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，立即用無(wú)菌的0.22 μm醋酸纖維濾膜抽濾水樣（若水體渾濁，可使用無(wú)菌的大孔膜預(yù)濾后再使用 0.22 μm 濾膜；如 1張 0.22 μm濾膜無(wú)法收集全部菌體，可使用多張濾膜 ）， 取出濾膜后馬上進(jìn)行樣品DNA抽提。 DNA可置于-20 ℃保存，長(zhǎng)期保存建議置于-80℃存放 。如無(wú)法進(jìn)行DNA抽提，請(qǐng)盡快將樣本置于液氮中冷凍 4小時(shí)以上，再轉(zhuǎn)移至-80℃保存 。
Q5：糞便樣本準(zhǔn)備注意事項(xiàng)？
A：采集新鮮糞便樣品并迅速置于無(wú)菌離心管中 ，置于冰盒（建議使用干冰，以利更好地（建議使用干冰，以利更好地保持微生物原貌）中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，馬上進(jìn)行DNA抽提。DNA可置于-20 ℃保存，長(zhǎng)期保存建議置于-80℃存放。如無(wú)法進(jìn)行DNA抽提，請(qǐng)盡快將樣本置于液氮中冷凍4小時(shí)以上，再轉(zhuǎn)移至-80℃保存 。
宏基因組測(cè)序研究廢水處理過(guò)程中淤泥微生物抗性基因及移動(dòng)元件
本文利用16S、宏基因組等技術(shù)研究在升溫厭氧消化處理污水的0d-57d天內(nèi)，淤泥中抗性基因、移動(dòng)元件以及抗性基因宿主微生物的變化。在0d時(shí)，共發(fā)現(xiàn)13類抗性基因（Antibiotic Resistance Genes, ARG），其中9種含量都超過(guò)1ppm，ARG 總量從125.97ppm（0d）降低至50.65ppm（57d），其中氯霉素抗性基因、多耐藥性抗性基因等抗性基因降低多達(dá)50%以上。高溫處理后，移動(dòng)元件總量由528.73ppm降低至391.36ppm。
本文研究表明，在消化處理淤泥過(guò)程中，隨溫度升高，會(huì)明顯降低淤泥中的抗性基因、移動(dòng)基因組元件以及抗性基因宿主微生物的含量，其中抗性基因的降低可能是與移動(dòng)元件以及宿主微生物的降低有關(guān)，因此高溫厭氧消化處理城市廢水污泥能夠有效的抑制抗性基因擴(kuò)散到環(huán)境中。
參考文獻(xiàn)
Tian Z, Zhang Y, Yu B, et al. Changes of resistome, mobilome and potential hosts of antibiotic resistance genes during the transformation of anaerobic digestion from mesophilic to thermophilic.[J]. Water Research, 2016, 98:261.
樣品聚類分析通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類樹(shù)，可以研究不同樣品之間的相似性。Bray-Curtis 距離是系統(tǒng)聚類法中使用最普遍的一個(gè)距離指標(biāo)，它主要用來(lái)刻畫(huà)樣品間的相近程度，它的大小是進(jìn)行樣品分類的主要依據(jù)。根據(jù)各物種在各樣品中的豐度表出發(fā)，以Bray-Curtis距離矩陣進(jìn)行樣品間聚類分 析，并將聚類結(jié)果與各樣品的物種相對(duì)豐度整合進(jìn)行展示。
KEGG注釋根據(jù)KEGG注釋總表，可以對(duì)KEGG注釋的總體情況進(jìn)行Unigene數(shù)目的統(tǒng)計(jì).
eggNOG分類統(tǒng)計(jì)圖eggNOG可以分為四個(gè)層次。第一層包括：1.信息存儲(chǔ)和加工；2.細(xì)胞過(guò)程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)； 3.新陳代謝；4.未確定分類。第二層進(jìn)一步細(xì)分成25個(gè)分類，每一個(gè)分類都可以用一個(gè)字母表示。第三層為共同功能描述（Consensus Functional Description）。第四層為具體的直系同源蛋白簇。將Unigenes與eggNOG庫(kù)的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)（blastp，evalue≤1e-5），取分值最高的eggNOG比對(duì)結(jié)果序列（Hits）的注釋作為該Unigene序列的注釋。結(jié)合eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)的層次結(jié)構(gòu)，可以統(tǒng)計(jì)出eggNOG各個(gè)層級(jí)或水平的信息。
CAZy柱狀圖CAZy是一個(gè)特殊的數(shù)據(jù)庫(kù)，致力于分析碳水化合物活性酶的基因組，結(jié)構(gòu)和生 信息等。CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)主要涵蓋 6 大功能類：糖苷水解酶，糖基轉(zhuǎn)移酶，多糖裂合酶，碳水化合物酯酶，輔助氧化還 原酶和碳水化合物結(jié)合模塊。6個(gè)功能大類又可以進(jìn)一步分成各功能小類，整個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)具有明顯的兩個(gè)層次的結(jié)構(gòu)。在過(guò)去的幾年里，CAZy分類家族不 斷擴(kuò)展，為基因組和宏基因組的分析提供更完備的數(shù)據(jù)。
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