背景簡介
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是在單細(xì)胞水平對(duì)轉(zhuǎn)錄組（mRNA）進(jìn)行測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞群體中真正起作用的細(xì)胞，特別適合對(duì)高度異質(zhì)性的干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及胚胎發(fā)育早期的細(xì)胞群體進(jìn)行研究，重新認(rèn)識(shí)細(xì)胞分子機(jī)制和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
10年轉(zhuǎn)錄組學(xué)項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，提供單細(xì)胞項(xiàng)目全程支持。
采用主流SMART技術(shù)，獲取單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄本。
嚴(yán)苛的質(zhì)控，確保單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)真實(shí)可靠。
成熟的轉(zhuǎn)錄組分析方案，深度繪制單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜
技術(shù)路線
分析內(nèi)容
樣本類型
total RNA或者單個(gè)/少量細(xì)胞
Q1：取樣用的離心管在使用前需要進(jìn)行預(yù)處理嗎？
A：需要。為了防止樣品污染，建議用紫外交聯(lián)儀照射處理20分鐘。
Q2：樣品取出后是直接保存在-80℃的冰箱中嗎？是否還需要其他處理呢？
A：分離后的細(xì)胞立即放入裂解液中，裝在裂解液中的樣品可在-80℃保存至多三個(gè)月，干冰保存送樣即可。
研究背景
先天淋巴細(xì)胞（ILCs）是一種免疫細(xì)胞，它通過釋放可溶性的因素調(diào)節(jié)對(duì)病毒、細(xì)菌和寄生蟲的早期免疫反應(yīng)。這些細(xì)胞可以根據(jù)細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子被分為三個(gè)亞型，每種亞型都有不同的功能。
方法流程
取材：用流式細(xì)胞儀分選患有阻塞性睡眠呼吸暫停綜合癥患者的扁桃體組織中的ILCs（Lin?CD127+）和NK cells（CD45+Lin?CD127? NKG2A+CD56+CD16? ） 。
建庫：1. Smart-seq2進(jìn)行單細(xì)胞擴(kuò)增；2. Nextera XT DNA Sample Preparation Index Kit構(gòu)建文庫。
測(cè)序：Illumina HiSeq 2000 3×106reads /樣本
分析：1. 質(zhì)控、數(shù)據(jù)篩選；2. 序列比對(duì)、基因表達(dá)分析及標(biāo)準(zhǔn)化處理；3. t-SNE細(xì)胞分型分析；4. SCDE基因差異表達(dá)分析。
研究結(jié)果
1. 細(xì)胞分型分析
采用PCA（主成分分析）和t-SNE對(duì)ILC中847個(gè)表達(dá)的基因進(jìn)行分型分析，將細(xì)胞分為4類：ILC1、ILC2、ILC3、NK cells。
2. SCDE基因差異表達(dá)分析
應(yīng)用SCDE軟件包對(duì)4類細(xì)胞的差異基因進(jìn)行分析，找出共有及特有差異基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD127+ILCs中共有的差異基因的表達(dá)量比NK細(xì)胞中明顯要高。
3. ILC1、ILC2、ILC3差異基因表達(dá)分析
結(jié)果表明，ILC1 cells共有79個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，參與干擾素γ的調(diào)控，ILC2 cells共有58個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因，在前列腺素、Notch信號(hào)通路及環(huán)境感應(yīng)中發(fā)揮作用，ILC3 cells共有371個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因，根據(jù)GO注釋有85個(gè)與免疫相關(guān)，且存在未知功能的基因。
4. ILC3細(xì)胞亞型分析
采用PCA和t-SNE分析ILC3中1,958個(gè)注釋的免疫基因，將ILC3分為3個(gè)亞型：Cluster A、Cluster B、Cluster C, 通過對(duì)這3種亞型細(xì)胞的分析，發(fā)現(xiàn)了新的免疫細(xì)胞CD62L+ ILC3。
研究結(jié)論
本研究通過對(duì)648個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的分析，應(yīng)用t-SNE細(xì)胞分型、SCDE基因差異表達(dá)分析，在ILC3中發(fā)現(xiàn)新的免疫細(xì)胞CD62L+ ILC3。
參考文獻(xiàn)
?sa K Bj?rklund, Forkel M, Picelli S, et al. The heterogeneity of human CD127+ innate lymphoid cells revealed by single-cell RNA sequencing[J]. Nature Immunology, 2016, 17(4):451.
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