腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成員之一，是一類無法自主復(fù)制、無被膜的二十面體微小病毒，其直徑約20-26nm，含有4.7kb左右的線狀單鏈DNA作為基因組。研究中采用的重組腺相關(guān)病毒載體（Recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型AAV基礎(chǔ)上改造而成的基因載體，由于其種類多樣、免疫原性極低、安全性高、宿主細(xì)胞范圍廣（對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力）、擴(kuò)散能力強(qiáng)、體內(nèi)表達(dá)基因時(shí)間長等，rAAV被視為最有前途的基因研究和基因治療載體之一。
AAV基因組及其編碼的蛋白（圖1）
1）rAAV包裝與純化
AAV病毒包裝過程中，包裝質(zhì)粒負(fù)責(zé)編碼目的基因以及兩個末端反向重復(fù)序列（ITR，對于病毒的復(fù)制和包裝具有決定性作用），輔助質(zhì)粒包含AAV包裝所需的 （編碼病毒衣殼蛋白）和 （參與病毒的復(fù)制）基因，以及腺病毒Helper質(zhì)粒。三種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，AAV病毒開始復(fù)制和包裝。聯(lián)川生物合作公司和元上海腺相關(guān)病毒的生產(chǎn)和質(zhì)控采取了國際學(xué)術(shù)界公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)流程，采用三質(zhì)粒系統(tǒng)在293T細(xì)胞中進(jìn)行包裝，共轉(zhuǎn)染后通過對細(xì)胞裂解物進(jìn)行密度梯度離心純化和收集病毒。
rAAV包裝及純化
rAAV滴度檢測
檢測方法：定量PCR檢測病毒基因組中外源DNA拷貝數(shù)
實(shí)驗(yàn)原理：腺相關(guān)病毒的基因組為單鏈DNA，外源DNA拷貝數(shù)代表病毒基因組拷貝數(shù)
2） rAAV侵染細(xì)胞過程
純化后的AAV病毒載體可以用于侵染細(xì)胞，侵染細(xì)胞時(shí)，AAV與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，激活胞內(nèi)信號通路，進(jìn)而觸發(fā)受體介導(dǎo)的AAV通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，在核內(nèi)體（Endosome）、高爾基體等細(xì)胞器的協(xié)助下進(jìn)入細(xì)胞核，隨后病毒裂解，其單鏈DNA需復(fù)制成為雙鏈DNA后表達(dá)目的基因。
腺相關(guān)病毒作用機(jī)制
3） AAV特點(diǎn)
1、 安全性高、免疫原性低：AAV是一種復(fù)制缺陷型DNA病毒，無自主復(fù)制能力，野生型AAV依賴rep基因進(jìn)行低頻定點(diǎn)整合，rAAV不整合。目前尚無由AAV引起的人類及哺乳動物疾病報(bào)道，也是FDA批準(zhǔn)上市的基因治療藥物中最安全的病毒載體之一。
2、 宿主細(xì)胞范圍廣：AAV具有廣泛的宿主范圍，對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。
3、 擴(kuò)散能力強(qiáng)：AAV直徑約20-26nm，體積小，滴度高，具有良好的擴(kuò)散能力，其中AAV-PHP.eB和AAV9具有跨血腦屏障的能力，在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。
4、 體內(nèi)表達(dá)基因時(shí)間長：AAV具有保持長期基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)能力，體內(nèi)表達(dá)一般3周可以達(dá)到高峰，隨后持續(xù)表達(dá)，作用時(shí)間＞5個月。
5、 載體容量?。?由于AAV的體積小，其是實(shí)驗(yàn)室常見病毒載體系統(tǒng)中裝載量最小的。AAV的兩個ITR之間所能容納的最大序列長度是4.7 kb。
6、 種類多樣：AAV血清型眾多，此外，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，我們還在不斷的突變，篩選新的血清型（AAV1-13，AAV2/1, 2/2, 2/5, 2/6, 2/8, 2/9, DJ; retro, PHP.eB…）。
目前已注冊的AAV種類總數(shù)已超過196種，靈長類動物體內(nèi)有13種不同血清型的AAV（即AAV1-AAV13），其中AAV2、AAV3、AAV9源自人類本身，值得注意的是，AAV2是最早被克隆的病毒，也是迄今研究最為徹底、應(yīng)用最為廣泛的病毒載體。隨著研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)不同血清型的AAV之間可以雜交，而雜交后的AAV會兼有雜合雙方的特點(diǎn)，因此，AAV亞型順勢誕生。
現(xiàn)在研究中常用的rAAV就是利用AAV2型基因組與不同的衣殼蛋白結(jié)合產(chǎn)生的混合體病毒載體，一般標(biāo)記為rAAV2/N (N為不同的衣殼血清型)。重組的病毒具有AAV2型的穩(wěn)定表達(dá)和基因整合能力，同時(shí)獲得了不同血清型的組織感染嗜親性（不同血清型衣殼表面的特定結(jié)構(gòu)位點(diǎn)決定了各自受體的特異性），表現(xiàn)出一定的器官靶向特異性（表1）。
表1 不同血清型AAV的組織嗜親性
小建議：如您不確定選擇哪種血清型，可嘗試使用和元上海Pandora’s Virus （AAV試用裝）進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過比較不同血清型對目標(biāo)組織的感染效果，摸索最佳實(shí)驗(yàn)條件（注射方法、注射位點(diǎn)、病毒用量等），以便得到更理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
基于上述特點(diǎn)，AAV被視為是一種高效和安全的體外及體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工具。尤其在整體水平研究中，與其他常用病毒工具載體相比，AAV具有感染過程溫和長效的表達(dá)能力，而成為基因操作的利器（表2）。
表2 不同病毒的生物學(xué)特性比較
4） AAV應(yīng)用案例
1、 廣譜及特異性
表3 常用啟動子列表
1.1 廣譜啟動子
客戶發(fā)表文章：EMBO Rep. (IF= 8.749). Li XG,et.al. (2019). Tau accumulation triggers STAT1-dependent memory deficits by suppressing NMDA receptor expression. [腺相關(guān)病毒, AD, 過表達(dá)，干擾]
注射部位：小鼠海馬CA3區(qū)
載體：AAV-CMV-Y701F-STAT1-RFP&AAV-CMV-hTau-EGFP
病毒滴度：5 × 1012 VG/mL&1.13 × 1013 VG/mL
觀察時(shí)間：1個月
1.2 特異性啟動子
客戶發(fā)表文章：Nature Neuroscience. (IF=19.912). Li YD,et.al. (2017). A distinct entorhinal cortex to hippo-campal CA1 direct circuit for olfactory associative learning. [腺相關(guān)病毒, 學(xué)習(xí)與記憶, 光遺傳]
注射部位：小鼠LEC區(qū)
載體：AAV-CaMKIIα-eNpHR3.0-EYFP
病毒滴度：2× 1012 VG/mL
觀察時(shí)間：1個月
AAV病毒載體配合特異性啟動子的選擇，可實(shí)現(xiàn)部分細(xì)胞類型的特異性表達(dá); 此外，借助Cre鼠（Cre-LoxP系統(tǒng)），利用AAV攜帶的DIO結(jié)構(gòu)可高精度靶向特異類型神經(jīng)元。
1.3 依賴Cre鼠特異性表達(dá)
客戶發(fā)表文章：PNAS. (IF=9.674). Du H,et.al. (2016). Dopaminergic inputs in the dentate gyrus direct the choice of memory encoding. [腺相關(guān)病毒, 學(xué)習(xí)與記憶, 光遺傳]
注射部位：TH-Cre小鼠VTA
載體：AAV-DIO-ChR2-mCherry
病毒滴度：1× 1013 VG/mL
注射體積：500nl
觀察時(shí)間：1個月
2、在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用
2.1 外側(cè)韁核&光遺傳學(xué)
客戶發(fā)表文章：Nature. (IF=41.577). Yang Y,et.al. (2018). Ketamine blocks bursting in the lateral habenula to rapidly relieve depression. [腺相關(guān)病毒, 抑郁癥, 光遺傳]
注射部位：小鼠LHb
載體：AAV2/9-hSyn-oChIEF-tdTomato
血清型：AAV2/9
病毒滴度：6.29× 1012 VG/mL
注射體積：100nl
觀察時(shí)間：1個月
2.2 臂旁核&化學(xué)遺傳學(xué)
客戶發(fā)表文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相關(guān)病毒, 癢, 光遺傳,化學(xué)遺傳]
注射部位：小鼠PBN
載體：AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine
血清型：AAV2/9
病毒滴度：1.0× 1013 VG/mL
注射體積：150nl
觀察時(shí)間：3周
2.3 丘腦&鈣離子成像
客戶發(fā)表文章：客戶發(fā)表文章：Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相關(guān)病毒, 覺醒]
注射部位：小鼠PVT
載體：AAV-CaMKIIα-GCaMP6f
注射體積：100nl
觀察時(shí)間：4周
2.4 丘腦室旁核&殺死神經(jīng)元
客戶發(fā)表文章：Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相關(guān)病毒, 覺醒]
注射部位：小鼠PVT
載體：AAV-CaMKIIα-Cre-GFP &AAV-DIO-caspase-3
注射體積：兩支病毒1:1混合注射100nl
觀察時(shí)間：4周
2.5 海馬、皮層&逆向非跨突觸（rAAV2-retro）
客戶發(fā)表文章：Biological Psychiatry. (IF=11.984). Bing Xing Pan,et.al. (2018). Chronic stress causes projection-specific adaptation of amygdala neurons via SK channel downregulation. [腺相關(guān)病毒, 焦慮癥, 光遺傳]
注射部位：小鼠dmPFC、VHPC
載體：AAV2/1-retro-Syn-eYFP-Cre、AAV2/8-CaMKIIα-DO-SK2&AAV2/8-CaMKIIα-DIO-SK2-mCherry
注射體積：300nl
觀察時(shí)間：4周
2.6 初級運(yùn)動皮層&順向跨突觸（rAAV2/1）
Nature Neuroscience. (IF=19.912). Yao J,et.al. (2018). A corticopontine circuit for initiation of urination. [腺相關(guān)病毒, 神經(jīng)環(huán)路]
注射部位：小鼠皮層M1、PMC
載體：rAAV2/1-hSyn-Cre&rAAV2/9-DIO-hChR2(H134R)-mCherry、rAAV2/9-DIO-GCaMP6s
病毒滴度：rAAV2/1: 5 × 1012 VG/mL；rAAV2/9-DIO-hChR2：1.2 × 1013 VG/mL；rAAV2/9-DIO-GCaMP6s：0.5 × 1012 VG/mL
注射體積：多點(diǎn)注射，每位點(diǎn)30-40nl
觀察時(shí)間：4周
2.7 邊緣前皮質(zhì)&跨突觸示蹤（WGA-Cre）
客戶發(fā)表文章：Science Advances. (IF=11.511). Ping Zheng,et.al. (2019). Crucial role of feedback signals from prelimbic cortex to basolateral amygdala in the retrieval of morphine withdrawal memory. [腺相關(guān)病毒, 成癮, AAV1, AAV-WGA-Cre]
注射部位：小鼠PrL
載體：AAV-hSyn-mCherry-IRES-WGA-Cre
病毒滴度：4.28 × 1012 VG/mL
注射體積：300nl
觀察時(shí)間：4周
2.8 全腦表達(dá)&跨血腦屏障（AAV-PHP.eB）
注射方式：尾靜脈注射
載體：pAAV-CMV-mScarlet-3FLAG& pAAV-CMV-mNeonGreen-3FLAG
血清型：AAV-PHP.eB
病毒滴度：1.10×1013 VG/mL&2.35×1013 VG/mL
注射體積：200nl（注射病毒總量：1.5×1013 VG）
觀察時(shí)間：3周
3、 皮層&AAV干擾（AAV-shRNA）
客戶發(fā)表文章：Nature Medicine. (IF=22.864). Cao X,et.al. (2013). Astrocyte-derived ATP modulates depressive-like behaviors.[腺相關(guān)病毒, 抑郁癥]
注射部位：小鼠mPFC
載體：AAV-CMV-P2rx2 shRNA-EGFP
病毒滴度：~3× 1012 VG/mL
注射體積：1.5ul
觀察時(shí)間：2周
4、 AAV稀疏標(biāo)記
應(yīng)用文獻(xiàn)：Luo WS, et al., (2016) Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci Rep.
載體信息：pAAV-PTRE-tight-NLS-Cre（108-109VG/mL）、pAAV-EF1a-DIO(tTA-P2A-mScarlet)-WPRE（1012VG/mL）
5、在視網(wǎng)膜中的應(yīng)用
玻璃體腔注射 玻璃體腔：AAV-syn-GcaMP6s
6、在肝臟中的應(yīng)用
客戶文章：FASEB Journal. (IF=5.391). Yang Y,et.al. (2018). Long-term exercise prevents hepatic steatosis: a novel role of FABP1 in regulation of autophagy-lysosomal machinery. [非酒精性脂肪肝，自噬溶酶體，腺相關(guān)病毒過表達(dá)]
注射方式：尾靜脈
載體：AAV8-TGB-Fabp1
血清型：rAAV2/8
注射體積： 200nl（病毒總量5×1011 VG）
觀察時(shí)間：1周
7、 在肺部中應(yīng)用
AAV-LUNG感染肺部結(jié)果
7、 在胰腺中的應(yīng)用
AAV-PAN感染結(jié)果
