原核轉(zhuǎn)錄組測序是指利用高通量測序技術(shù)對(duì)原核生物的轉(zhuǎn)錄本（mRNA和非編碼RNA）進(jìn)行測序，全面快速地獲取特定微生物在特定狀態(tài)下的所有轉(zhuǎn)錄本的信息。通過轉(zhuǎn)錄組測序不僅能夠?qū)RNA進(jìn)行表達(dá)定量分析，分析差異表達(dá)基因及其相應(yīng)功能，同時(shí)還能夠分析Non-coding RNA（sRNAs），揭示微生物不同表型形成的分子調(diào)控機(jī)制和功能。 由于原核生物mRNA不具有polyA尾結(jié)構(gòu)，需要采用去除rRNA的方法構(gòu)建文庫，聯(lián)川生物針對(duì)不同的研究物種采取有效的方法去除rRNA，保證數(shù)據(jù)質(zhì)量。
技術(shù)優(yōu)勢
磁珠法去除rRNA，rRNA去除效率好，數(shù)據(jù)質(zhì)量高
采用鏈特異性建庫，建庫穩(wěn)定性好
除進(jìn)行mRNA定量分析外，還可以進(jìn)行反義轉(zhuǎn)錄本預(yù)測，基因結(jié)構(gòu)分析等；
可以同時(shí)進(jìn)行mRNA和sRNA分析，sRNA 預(yù)測，變異分析等
技術(shù)路線
分析內(nèi)容
樣本類型
微生物菌體（≥ 5×107），組織，環(huán)境樣品，總RNA等
建議總RNA起始量：≥3μg；濃度：≥70 ng/μL。
Q：原核生物與真核生物在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序文庫構(gòu)建時(shí)有什么區(qū)別？A：在原核生物中，mRNA只占全部RNA的1-5%，其余絕大部分是核糖體RNA（rRNA），因此在開展轉(zhuǎn)錄組測序前，需先將mRNA純化。然而，原核生物mRNA不具有polyA結(jié)構(gòu)，無法直接利用oligoT將mRNA純化出來，如果直接用total RNA進(jìn)行測序，數(shù)據(jù)質(zhì)量將非常差，大部分序列都來自rRNA。
提高原核生物中mRNA的量，最主要的方式是去除total RNA中的rRNA。在建庫過程中顯加入磁珠將rRNA吸附，過濾掉磁珠后的體系再進(jìn)行下游建庫。
全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組揭示藍(lán)藻對(duì)青藏高原極端氣候的適應(yīng)機(jī)制
研究背景
青藏高原不僅是世界上最高且規(guī)模最大的高原，同時(shí)具有包括極大的溫差、低氧濃度、低壓、強(qiáng)紫外線輻射以及狂風(fēng)等在內(nèi)的極端環(huán)境，且有許多獨(dú)特的環(huán)境，包括雪山、鹽水湖泊及干旱沙 漠等，具有極高的生物多樣性，為研究適應(yīng)性進(jìn)化提供了一個(gè)理想的天然實(shí)驗(yàn)室。藍(lán)藻是最早的光合放氧生物，幾乎可以將所有緯度范圍的地區(qū)作為棲息地，對(duì)于全球生態(tài)具有相當(dāng)大的重要 性；藍(lán)藻可以適應(yīng)可變滲透壓、持續(xù)低溫及強(qiáng)烈的紫外線輻射等環(huán)境。
研究結(jié)果
青藏高原藍(lán)藻基因組序列是 5.9 Mb，具有 39.2%的 G+C 含量，總共包括5362 個(gè) CDS。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，這一菌株屬于 Trichormus 和 Anabaena 集群。T. sp. NMC-1 和6個(gè)近 緣種之間的基因組對(duì)比顯示，在 T. sp. NMC-1 基因組中，功能未知的基因占據(jù)了更高的比例(28.12%)。
轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)顯著上調(diào)的基因參與膜生物起源、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源、次生代謝產(chǎn)物生物合成、氨基酸運(yùn)輸和代謝、防御機(jī)制等過程；相比之下，下調(diào)基因主要參與信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、膜生物起源及能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換。進(jìn)一步的分析表明，CheY-like 基因、胞外多糖和類菌胞素氨基酸樣的氨基酸，可能在極端環(huán)境的適應(yīng)性中扮演重要的角色。
研究結(jié)論
青藏高原引起極端環(huán)境而具有最高的生物多樣性，為研究適應(yīng)性進(jìn)化提供了一個(gè)理想的天然實(shí)驗(yàn)室。該研究繪制了青藏高原藍(lán)藻的基因組序列草圖，并在低溫下進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測序，以探討 T. sp. NMC-1 適應(yīng)特殊環(huán)境的遺傳學(xué)機(jī)制。明顯正向選擇的、擴(kuò)張純正群的和差異表達(dá)的一些基因參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞壁/膜生物起源、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換，旨在闡 述特殊的適應(yīng)特征。這些結(jié)果表明，藍(lán)藻對(duì)青藏高原極端環(huán)境的適應(yīng)性背后，有著復(fù)雜的遺傳學(xué)機(jī)制。
參考文獻(xiàn)
Qin Q, Huang Y, Ji Q, et al. The genome and transcriptome ofTrichormussp. NMC-1: insights into adaptation to extreme environments on the Qinghai-Tibet Plateau:[J]. Scientific Reports, 2016, 6:29404.
差異基因 GO 富集 DAG 圖有向無環(huán)圖(Directed Acyclic Graph， DAG)為差異基因GO富集分析結(jié)果的圖形化展示方式。圖中的分支代表包含關(guān)系，從上至下所定義的功能范圍越來越小，一般選取GO富集分析的結(jié)果前10位作為有向無環(huán)圖的主節(jié)點(diǎn)，并通過包含關(guān)系，將相關(guān)聯(lián)的GO Term一起展示，顏色的深淺代表富集程度。
差異基因表達(dá)模式聚類將有顯著差異的基因/轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行表達(dá)模式聚類分析，采用距離計(jì)算算法： 樣本間為spearman，基因間為pearson，采用的聚類方法為hcluster（complete算法）。
sRNA 預(yù)測原核生物中，長度在 50～500nt 的非編碼 RNA 通常定義為小 RNA(small RNA, sRNA)。用 Rockhopper 軟件 發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本， 通過將其與 Uniport 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，將未注釋到數(shù)據(jù)庫的轉(zhuǎn)錄本作為潛在的非編碼 sRNA。用RNAFold 分析其莖環(huán)結(jié)構(gòu)，進(jìn)行 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。
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