背景簡(jiǎn)介
數(shù)據(jù)非依賴(lài)性的掃描模式(Data-independent acquisition, DIA)是近幾年來(lái)發(fā)展的一種新的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集方式?？梢詫?duì)特定質(zhì)量范圍內(nèi)的所有母離子進(jìn)行碎裂，采集所有母離子的碎片離子信息進(jìn)行蛋白定性和定量。目前流行的蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段，如iTRAQ\TMT、 Label-free、SILAC采用的都是數(shù)據(jù)依賴(lài)性的掃描模式(Data-dependent acquisition, DDA)。相對(duì)于DDA， DIA 具有更好的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一大重要趨勢(shì)。下圖為 DIA 定量技術(shù)原理圖：
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
靈敏度高，無(wú)歧視地獲得所有肽段的信息，不會(huì)造成低豐度蛋白信息的丟失 循環(huán)時(shí)間固定，掃描點(diǎn)數(shù)均勻，定量準(zhǔn)確度高 重復(fù)性好，重復(fù)樣品間的定量相關(guān)性可達(dá)到0.99以上。
技術(shù)路線
分析內(nèi)容
樣本類(lèi)型
蛋白質(zhì)溶液，組織樣品、細(xì)胞及體液樣品（具體送樣量請(qǐng)咨詢(xún)各駐地項(xiàng)目經(jīng)理）
代表性文章
Collins B C , Hunter C L , Liu Y , et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry[J]. Nature Communications, 2017, 8(1):291.Rouwette T , Sondermann J , Avenali L , et al. Standardized profiling of the membrane-enriched proteome of mouse dorsal root ganglia provides novel insights into chronic pain[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2016, 15(6):mcp.M116.058966.
Q1：蛋白質(zhì)定量DIA和傳統(tǒng)的非標(biāo)記定量有何優(yōu)勢(shì)
A：傳統(tǒng)的非標(biāo)記定量一般需要通過(guò)分級(jí)的方法開(kāi)展，耗時(shí)久、重復(fù)性差、數(shù)據(jù)結(jié)果可信度不高；蛋白定量DIA技術(shù)是新一代非標(biāo)記定量技術(shù)，可通過(guò)更優(yōu)的數(shù)據(jù)采集模式，在相同時(shí)間采集到更豐富的信息，壓縮周期的同時(shí)，大福度提高樣本間平行比較的重復(fù)性，數(shù)據(jù)結(jié)果可信度極高。
蛋白質(zhì)定量DIA用于慢性疼痛的研究
Standardized Profiling of The Membrane-Enriched Proteome of Mouse Dorsal Root Ganglia (DRG) Provides Novel Insights Into Chronic Pain. Molecular & Cellular Proteomics. 2016.
研究背景
慢性疼痛是一種治療方案有限的復(fù)雜疾病。雖對(duì)其發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了多次研究，但各結(jié)果間存在較大不一致性，主要受限于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組shotgun技術(shù)固有的缺陷。發(fā)病機(jī)制依然不清晰。
研究結(jié)果
大量數(shù)據(jù)表明CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、EpCAM等表面標(biāo)志物可以定義CSC，研究人員選擇CD24、CD133、EpCAM分選HuH1和HuH7不同細(xì)胞亞群，用于研究CSC生物學(xué)和分子水平異質(zhì)性。免疫熒光染色表明，在兩種細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)下（單層培養(yǎng)、球體培養(yǎng)）,兩個(gè)HCC細(xì)胞系均表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞異質(zhì)性。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
炎癥性疼痛和神經(jīng)性疼痛兩種模型鼠及其對(duì)應(yīng)control鼠共4組，各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)
每個(gè)生物學(xué)重復(fù)由10-13只鼠pooling而成
解剖獲得同側(cè)背根神經(jīng)節(jié)膜部分提取蛋白進(jìn)行DIA蛋白定量
圖 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)類(lèi)型
主要發(fā)現(xiàn)
1）DDA建庫(kù)鑒定到3067個(gè)蛋白，迄今鑒定數(shù)最多的背根神經(jīng)節(jié)蛋白研究。
2）DIA四組都鑒定到的蛋白有2526個(gè)，其中CFA和Vehicle都鑒定到的有2581個(gè)；SNI和Sham都鑒定到的2600個(gè)，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好。
3）炎癥性和神經(jīng)性疼痛差異蛋白分別為64和77，兩種模式共有差異蛋白為12個(gè)。
4）其中Serca蛋白在兩種模式小鼠中表達(dá)量變化相反，表明兩種疼痛的調(diào)控機(jī)制不同。
5）western blot和免疫組化對(duì)上述DIA結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證
圖 四組實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷牡鞍拙垲?lèi)分析
參考文獻(xiàn)Rouwette T , Sondermann J , Avenali L , et al. Standardized profiling of the membrane-enriched proteome of mouse dorsal root ganglia provides novel insights into chronic pain[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2016, 15(6):mcp.M116.058966
結(jié)構(gòu)域注釋柱狀圖Interproscan是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和功能注釋最常用的軟件之一。為了能更全面的進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的注釋?zhuān)琁nterproscan整合了一些最常用的結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)，包括 Pfam、ProDom、 SMART 等結(jié)構(gòu)域的數(shù)據(jù)庫(kù)，利用模式結(jié)構(gòu)或特征進(jìn)行功能未知蛋白的結(jié)構(gòu)域注釋?zhuān)L制結(jié)構(gòu)域注釋的柱狀圖。橫坐標(biāo)代表蛋白數(shù)目，縱坐標(biāo)代表注釋到的 IPR 條目。
蛋白表達(dá)水平聚類(lèi)圖
蛋白表達(dá)水平聚類(lèi)分析用于判斷不同實(shí)驗(yàn)條件下蛋白表達(dá)量的相關(guān)性。每個(gè)樣品都會(huì)得到一個(gè)絕對(duì)或相對(duì)蛋白表達(dá)集合，將所有樣品表達(dá)集合并在一起，用于層次聚類(lèi)分析和 K-means 聚類(lèi)分析。
KEGG 富集通路圖在 KEGG 通路圖中，圈出了差異蛋白， 其中綠底色框內(nèi)為鑒定出的總蛋白， 藍(lán)色框標(biāo)記的是下調(diào)差異蛋白，紅色 框標(biāo)記的是上調(diào)差異蛋白，黃色框標(biāo) 記的是通路中該功能對(duì)應(yīng)的多個(gè)蛋白中既有上調(diào)差異蛋白、也有下調(diào)差異 蛋白。
差異蛋白互作分析利用 StringDB 蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 鑒定蛋白的互作分析，若在數(shù) 據(jù)庫(kù)中有相應(yīng)的物種，則直接提取相應(yīng)物種的序 列，若無(wú)，則提取近 源物種的序列，然 后將差異蛋白的序列與提取出的序列進(jìn) 行 blast 比 對(duì)，得出相應(yīng)的互作信息，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。
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