血腦屏障是指腦毛細血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細胞形成的血漿與腦細胞之間的屏障和由脈絡叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障，這些屏障能夠阻止某些物質(zhì)(多半是有害的)由血液進入腦組織。血腦屏障可使腦組織少受甚至不受循環(huán)血液中有害物質(zhì)的損害，從而保持腦組織內(nèi)環(huán)境的基本穩(wěn)定，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生物學意義。
采用永生化細胞系建立的BBB模型應運而生，較為常用的永生化內(nèi)皮細胞系如小鼠bEnd3和bEnd5，豬PBMEC/C1-2和人hCMEC/D3，以及非腦細胞系如CaCo-2，MDCK-MDR1，Huvecs和ECV304等。
評價體外模型成功與否的指標，主要基于體外模型的滲透性以及內(nèi)皮細胞特定酶類的表達、緊密連接的形成。
1. Transwell預處理：移液器吸取2%明膠溶液100μl，放入Transwell上室中，浸潤PET膜，置于37℃，5%CO2細胞孵箱靜置30min，進行包被，用移液器吸出棄去明膠溶液，備用。
2. 體外BBB模型建立：當T25培養(yǎng)瓶中細胞生長密度大于 80-90%，進行細胞傳代。棄去培養(yǎng)基，加入1ml PBS 緩慢沖洗培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞，重復3次。
3. 加入1ml 0.25%胰酶，完全浸潤細胞表面，放置 37℃細胞孵箱中靜置消化 3-5min，在電子顯微鏡下觀察，當細胞形態(tài)變圓回縮后，雙手輕輕拍打培養(yǎng)瓶使絕大部分細胞脫落，快速加入 5ml 細胞完全培養(yǎng)基終止消化。
4. 使用移液器將 T25 培養(yǎng)瓶中的細胞懸液吸出至 15ml 的離心管中，離心，1000rpm，5min。使用移液器將離心管中上清液吸出棄去，加入細胞完全培養(yǎng)基重懸細胞。
5. 將細胞接種于包被了 2%明膠的 Transwell 小室上室的 PET 膜上，加至 250ul Huvecs 細胞完全培養(yǎng)基。將 C6 細胞接種于 24 孔 Transwell 小室的下室，加入 C6 完全培養(yǎng)基至 1000ul，保持 Transwell 小室上下室之間液面相平。設置實驗組、單細胞組及空白對照組。
6. 每天換液并定時觀察細胞的生長情況。大約 6-8 天觀察細胞基本融合后，進行體外 BBB 模型評價的系列實驗。
