血腦屏障是指腦毛細血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細胞形成的血漿與腦細胞之間的屏障和由脈絡(luò)叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障，這些屏障能夠阻止某些物質(zhì)(多半是有害的)由血液進入腦組織。血腦屏障可使腦組織少受甚至不受循環(huán)血液中有害物質(zhì)的損害，從而保持腦組織內(nèi)環(huán)境的基本穩(wěn)定，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生物學(xué)意義。
采用永生化細胞系建立的BBB模型應(yīng)運而生，較為常用的永生化內(nèi)皮細胞系如小鼠bEnd3和bEnd5，豬PBMEC/C1-2和人hCMEC/D3，以及非腦細胞系如CaCo-2，MDCK-MDR1，Huvecs和ECV304等。
評價體外模型成功與否的指標，主要基于體外模型的滲透性以及內(nèi)皮細胞特定酶類的表達、緊密連接的形成。
1. Transwell預(yù)處理：移液器吸取2%明膠溶液100μl，放入Transwell上室中，浸潤PET膜，置于37℃，5%CO2細胞孵箱靜置30min，進行包被，用移液器吸出棄去明膠溶液，備用。
2. 體外BBB模型建立：當T25培養(yǎng)瓶中細胞生長密度大于 80-90%，進行細胞傳代。棄去培養(yǎng)基，加入1ml PBS 緩慢沖洗培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞，重復(fù)3次。
3. 加入1ml 0.25%胰酶，完全浸潤細胞表面，放置 37℃細胞孵箱中靜置消化 3-5min，在電子顯微鏡下觀察，當細胞形態(tài)變圓回縮后，雙手輕輕拍打培養(yǎng)瓶使絕大部分細胞脫落，快速加入 5ml 細胞完全培養(yǎng)基終止消化。
4. 使用移液器將 T25 培養(yǎng)瓶中的細胞懸液吸出至 15ml 的離心管中，離心，1000rpm，5min。使用移液器將離心管中上清液吸出棄去，加入細胞完全培養(yǎng)基重懸細胞。
5. 將細胞接種于包被了 2%明膠的 Transwell 小室上室的 PET 膜上，加至 250ul Huvecs 細胞完全培養(yǎng)基。將 C6 細胞接種于 24 孔 Transwell 小室的下室，加入 C6 完全培養(yǎng)基至 1000ul，保持 Transwell 小室上下室之間液面相平。設(shè)置實驗組、單細胞組及空白對照組。
6. 每天換液并定時觀察細胞的生長情況。大約 6-8 天觀察細胞基本融合后，進行體外 BBB 模型評價的系列實驗。
