骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是存在于哺乳動物的骨髓基質中的一種具有分化形成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)及成肌細胞的多種分化潛能的細胞亞群。
1. 將5-7日齡大乳鼠處死,剝離出雙側股骨及脛骨;
2. 骨兩端剪口后,1ml無菌注射器吸取DMEM反復沖洗骨髓腔;
3. 收集細胞懸液,3ml完全培養(yǎng)基(含10%血清)重懸細胞,接種于6cm細胞培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);
4. 16-24小時后倒置顯微鏡觀察細胞貼壁情況,吸除培養(yǎng)基及未貼壁細胞,PBS沖洗,加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
5. 三天內(nèi)每日觀察細胞生長情況并PBS沖洗、換液,后隔日換液。
6. 細胞融高于90%時,吸除培養(yǎng)基,PBS沖洗,加入胰蛋白酶溶液 1ml,37°C 消化貼壁細胞2-3min;
7. 顯微鏡下觀察細胞皺縮變圓后,加入 1ml 完全培養(yǎng)基終止消化。
8. 加入完全培養(yǎng)基重懸細胞,并接種細胞于新的培養(yǎng)皿內(nèi),培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每日觀察細胞生長情況,隔日換液。
9. 標記蛋白檢測。