骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是存在于哺乳動物的骨髓基質(zhì)中的一種具有分化形成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)及成肌細(xì)胞的多種分化潛能的細(xì)胞亞群。
1. 將5-7日齡大乳鼠處死,剝離出雙側(cè)股骨及脛骨;
2. 骨兩端剪口后,1ml無菌注射器吸取DMEM反復(fù)沖洗骨髓腔;
3. 收集細(xì)胞懸液,3ml完全培養(yǎng)基(含10%血清)重懸細(xì)胞,接種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);
4. 16-24小時(shí)后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁情況,吸除培養(yǎng)基及未貼壁細(xì)胞,PBS沖洗,加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
5. 三天內(nèi)每日觀察細(xì)胞生長情況并PBS沖洗、換液,后隔日換液。
6. 細(xì)胞融高于90%時(shí),吸除培養(yǎng)基,PBS沖洗,加入胰蛋白酶溶液 1ml,37°C 消化貼壁細(xì)胞2-3min;
7. 顯微鏡下觀察細(xì)胞皺縮變圓后,加入 1ml 完全培養(yǎng)基終止消化。
8. 加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,并接種細(xì)胞于新的培養(yǎng)皿內(nèi),培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞生長情況,隔日換液。
9. 標(biāo)記蛋白檢測。