背景簡介
單細胞轉(zhuǎn)錄組測序是在單細胞水平對轉(zhuǎn)錄組（mRNA）進行測序的一項新技術(shù)，可發(fā)現(xiàn)細胞群體中真正起作用的細胞，特別適合對高度異質(zhì)性的干細胞、腫瘤細胞及胚胎發(fā)育早期的細胞群體進行研究，重新認識細胞分子機制和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
技術(shù)優(yōu)勢
10年轉(zhuǎn)錄組學項目經(jīng)驗，提供單細胞項目全程支持。
采用主流SMART技術(shù)，獲取單細胞全長轉(zhuǎn)錄本。
嚴苛的質(zhì)控，確保單細胞實驗真實可靠。
成熟的轉(zhuǎn)錄組分析方案，深度繪制單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜
技術(shù)路線
分析內(nèi)容
樣本類型
total RNA或者單個/少量細胞
Q1：取樣用的離心管在使用前需要進行預(yù)處理嗎？
A：需要。為了防止樣品污染，建議用紫外交聯(lián)儀照射處理20分鐘。
Q2：樣品取出后是直接保存在-80℃的冰箱中嗎？是否還需要其他處理呢？
A：分離后的細胞立即放入裂解液中，裝在裂解液中的樣品可在-80℃保存至多三個月，干冰保存送樣即可。
研究背景
先天淋巴細胞（ILCs）是一種免疫細胞，它通過釋放可溶性的因素調(diào)節(jié)對病毒、細菌和寄生蟲的早期免疫反應(yīng)。這些細胞可以根據(jù)細胞表面的轉(zhuǎn)錄因子及細胞因子被分為三個亞型，每種亞型都有不同的功能。
方法流程
取材：用流式細胞儀分選患有阻塞性睡眠呼吸暫停綜合癥患者的扁桃體組織中的ILCs（Lin?CD127+）和NK cells（CD45+Lin?CD127? NKG2A+CD56+CD16? ） 。
建庫：1. Smart-seq2進行單細胞擴增；2. Nextera XT DNA Sample Preparation Index Kit構(gòu)建文庫。
測序：Illumina HiSeq 2000 3×106reads /樣本
分析：1. 質(zhì)控、數(shù)據(jù)篩選；2. 序列比對、基因表達分析及標準化處理；3. t-SNE細胞分型分析；4. SCDE基因差異表達分析。
研究結(jié)果
1. 細胞分型分析
采用PCA（主成分分析）和t-SNE對ILC中847個表達的基因進行分型分析，將細胞分為4類：ILC1、ILC2、ILC3、NK cells。
2. SCDE基因差異表達分析
應(yīng)用SCDE軟件包對4類細胞的差異基因進行分析，找出共有及特有差異基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD127+ILCs中共有的差異基因的表達量比NK細胞中明顯要高。
3. ILC1、ILC2、ILC3差異基因表達分析
結(jié)果表明，ILC1 cells共有79個上調(diào)表達基因，參與干擾素γ的調(diào)控，ILC2 cells共有58個上調(diào)表達的基因，在前列腺素、Notch信號通路及環(huán)境感應(yīng)中發(fā)揮作用，ILC3 cells共有371個上調(diào)表達的基因，根據(jù)GO注釋有85個與免疫相關(guān)，且存在未知功能的基因。
4. ILC3細胞亞型分析
采用PCA和t-SNE分析ILC3中1,958個注釋的免疫基因，將ILC3分為3個亞型：Cluster A、Cluster B、Cluster C, 通過對這3種亞型細胞的分析，發(fā)現(xiàn)了新的免疫細胞CD62L+ ILC3。
研究結(jié)論
本研究通過對648個單細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組的分析，應(yīng)用t-SNE細胞分型、SCDE基因差異表達分析，在ILC3中發(fā)現(xiàn)新的免疫細胞CD62L+ ILC3。
參考文獻
?sa K Bj?rklund, Forkel M, Picelli S, et al. The heterogeneity of human CD127+ innate lymphoid cells revealed by single-cell RNA sequencing[J]. Nature Immunology, 2016, 17(4):451.
