背景簡介
狹義的轉(zhuǎn)錄組默認只包含mRNA，但是廣義的轉(zhuǎn)錄組指的是細胞或組織中所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，其中包含mRNA和非編碼RNA（non-coding RNA, ncRNA）。非編碼RNA目前的研究多集中在具有調(diào)控功能的small RNA（以miRNA為代表），長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）和環(huán)狀RNA（circular RNA, circRNA）上，而這幾類ncRNA的調(diào)控對象都和mRNA有關(guān)。因此，全轉(zhuǎn)錄組即包含了ncRNAs和mRNA。全轉(zhuǎn)錄組測序即對以上四種ncRNA進行測序，并分析這四者之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系。
技術(shù)優(yōu)勢
文庫優(yōu)化：針對不同長度序列采用兩種文庫構(gòu)建方法，去核糖體鏈特異性文庫可獲得mRNA、lncRNA和circRNA信息。
數(shù)據(jù)全面：全轉(zhuǎn)錄組測序可獲取4類主要RNA（miRNA，mRNA，lncRNA，circRNA）數(shù)據(jù)，可對這些數(shù)據(jù)進行標準分析及整合分析
關(guān)聯(lián)全面：通過對mRNA /miRNA/lncRNA/circRN序列測定及后續(xù)分析，深入開展全轉(zhuǎn)錄組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(ceRNA網(wǎng)絡(luò))分析
技術(shù)路線
分析內(nèi)容
樣本類型
細胞，組織，體液、血清、血漿、全血，總RNA等
建議總RNA起始量：＞15 μg，濃度≥200 ng/μL
近期用戶文章
1. Sun JC, et al. (2016) A computationally constructed ceRNA interaction network based on a comparison of the SHEE and SHEEC cell lines. Cell Mol Biol Lett 21 (1) :21.
2. Wang Wei, et al. (2017) Identification of miRNA, lncRNA and mRNA-associated ceRNA networks and potential biomarker for MELAS with mitochondrial DNA A3243G mutation. Scientific Reports 7 :41639.
Q1：全轉(zhuǎn)錄組測序為什么需要構(gòu)建兩個文庫？
A：全轉(zhuǎn)錄組測序需要構(gòu)建2個測序文庫，一個小RNA文庫和一個去除核糖體RNA的鏈特異性文庫，然后分別上機測序。小RNA長度較短，一般小于50nt，采用測序策略為50SE。其他三類RNA序列一般大于200，通常在1000以上，最高可達幾萬，通過片段化構(gòu)建150PE測序文庫。最后小RNA文庫可以獲得miRNA序列信息，去核糖體的鏈特異性文庫可以獲得mRNA、lncRNA和circRNA的序列信息。
Q2：什么是ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（ceRNA networks）？
A：一些非編碼RNA，如lncRNA和circRNA等會競爭結(jié)合miRNA，導(dǎo)致miRNA調(diào)控的靶基因發(fā)生變化。這類新型的非編碼RNA除了轉(zhuǎn)錄前調(diào)控等功能外，一個重要的功能就是像海綿一樣對miRNA有吸附作用。這種具有miRNA吸附作用的RNA，我們稱作內(nèi)源性競爭結(jié)合RNA（Competitive endogenous RNA, ceRNA），具體的相互作用關(guān)系如下圖：
circular RNA(HRCR)靶標結(jié)合miR-223保護心臟免受心肌肥厚和心臟衰竭
本研究中作者首先通過miRNA基因芯片分析、Northern blot、RT-PCR等技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)，ISO處理14天后，miRNA-223的表達量顯著上調(diào)，并且在患有心臟肥厚和心臟衰竭的人和小鼠心臟中miRNA-223的表達量也有明顯的上調(diào)，初步得出結(jié)論：miRNA-223參與調(diào)控心肌肥厚和心臟衰竭。接下來作者利用miR-223過表達轉(zhuǎn)基因小鼠以及miR-223基因敲除轉(zhuǎn)基因小鼠進一步驗證表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-223過表達小鼠成年后出現(xiàn)明顯的心肌肥厚和心臟衰竭癥狀，而miR-223基因敲除小鼠表型相反，進一步證明在活體內(nèi)，miR-223可以誘導(dǎo)心肌肥厚和心臟衰竭。
接下來作者進一步研究miR-223對心肌細胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-223過表達細胞中出現(xiàn)明顯的心肌肥大反應(yīng)，而miR-223敲除細胞中，ISO處理引起的心肌肥大反應(yīng)明顯被破壞，說明miR-223過表達會促進心肌肥厚，而miR-223基因敲除會阻斷心肌肥厚。
為了進一步研究miR-223調(diào)控心肌肥厚和心臟衰竭的分子機制，作者篩選了一些參與調(diào)控心肌肥厚的基因作為miR-223的靶標候選基因，然后通過western blot分析miR-223過表達和缺失突變體中上調(diào)以及下調(diào)的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-223可以顯著抑制ARC的表達，而前人已經(jīng)有研究報道ARC參與調(diào)控心肌肥厚和細胞凋亡，所以初步推斷ARC可能是miR-223下游的靶標位點。
接下來作者通過RNAhybrid分析發(fā)現(xiàn)，ARC的3′UTR含有潛在的miR-223的結(jié)合位點，然后通過Target Protector technology進一步證明miR-223可以特異調(diào)控ARC的表達，ARC 3′UTR的翻譯活性受到miR-223的抑制。
接下來作者構(gòu)建了一個不帶ARC 3′UTR的腺病毒載體，這種病毒載體對miR-223不敏感，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種腺病毒可以減弱ISO處理誘導(dǎo)的心肌肥厚反應(yīng)。然后作者通過ARC過表達轉(zhuǎn)基因株系進一步證明了ARC可以保護心臟免受心肌肥厚和心臟衰竭，減少細胞凋亡。以上這些研究結(jié)論表明：在調(diào)控心肌肥厚和心臟衰竭的過程中，ARC是miR-223的下游靶標位點。
CircRNA和miRNA的互作是目前研究的一個熱點話題，為了進一步研究是否有CircRNA參與調(diào)控miR-223的表達，作者從CircRNA數(shù)據(jù)庫中隨機篩選出100個CircRNA，通過qRT-PCR驗證篩選到36個CircRNA，然后通過Northern blot篩選到一個特異性表達的CircRNA: mm9-circ-012559(HRCR)。
然后作者通過RNAhybrid分析發(fā)現(xiàn)HRCR包含6個CircRNA的靶標結(jié)合位點，初步表明HRCR可以和miR-223結(jié)合。接下來作者通過生物素標記，qRT-PCR，Northern bolt，pull down assay、熒光原位雜交（FISH）等技術(shù)手段，從正向以及反向兩個角度分別驗證HRCR和miR-223之間的互作關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-223和HRCR在細胞質(zhì)中存在共定位現(xiàn)象，HRCR可以直接結(jié)合到miR-223上。
HRCR和miR-223存在互作，而miR-223可以通過調(diào)控下游ARC的表達，進而調(diào)控心肌肥厚和心臟衰竭，為了進一步研究HRCR對ARC表達的影響，作者構(gòu)建了HRCR過表達載體和基因敲除突變體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HRCR過表達載體中，ARC的表達量和活性顯著增加，HRCR敲除突變體中，ARC的表達量和活性顯著降低，并且HRCR可以消除miR-223對ARC表達的抑制作用，說明HRCR可以通過調(diào)控miR-223以及ARC的表達，進而調(diào)控心肌肥厚。
參考文獻
Wang K, Long B, Liu F, et al. A circular RNA protects the heart from pathological hypertrophy and heart failure by targeting miR-223.[J]. European Heart Journal, 2016, 37(33):2602-2611.
