背景簡介
iTRAQ ( Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation) 技術(shù)是ABI公司推出的一項新的體外同位素標(biāo)記技術(shù)。使用該技術(shù)可以對一個基因組表達的全部蛋白質(zhì)或一個復(fù)雜的混合體系中的所有蛋白質(zhì)進行精確定量和鑒定。尋找差異表達蛋白，并揭示其細胞生理病理功能。聯(lián)川生物依托先進的蛋白質(zhì)譜分析平臺、強大的信息分析和數(shù)據(jù)處理能力，為用戶提供高效的蛋白質(zhì)組鑒定與定量分析服務(wù)。
技術(shù)優(yōu)勢
通量高：一次實驗即可對數(shù)千種蛋白進行定量分析，且最多可同時對8份樣本進行定量分析
結(jié)果可靠：蛋白分析的靈敏度、特異性及重復(fù)性遠高于雙向電泳，并且定性與定量分析同步完成
覆蓋廣泛：鑒定與定量分析樣本中表達的所有已知蛋白，包括高分子量蛋白、酸堿性蛋白、膜蛋白和不溶性蛋白等
支持關(guān)聯(lián)分析：綜合上游轉(zhuǎn)錄組等實驗數(shù)據(jù)，提供多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析
技術(shù)路線
分析內(nèi)容
樣本類型
細胞，組織，尿液，全血，血清，血漿，總蛋白等
建議總蛋白起始量（單次）：≥ 500 μg，濃度≥1μg/μL
用戶文章：
1.Wang L，et al. Proteome profiling reveals immune responses in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) infected with Edwardsiella tarda by iTRAQ analysis. Fish Shellfish Immunol. 2017 Jul;66:325-333. doi: 10.1016/j.fsi.2017.05.022
2.Zhang G, Zhang J, Wen X, et al. Comparative iTRAQ-based quantitative proteomic analysis of Pelteobagrus vachelli liver against acute hypoxia: Implications in metabolic responses.[J]. Proteomics, 2017.
3.Li R, Yu H, Yue Y, et al. Combined proteomics and transcriptomics identifies sting-related toxins of jellyfish Cyanea nozakii.[J]. Journal of Proteomics, 2016, 148:57.
4.Lv LX, et al.(2016) Integrated transcriptomic and proteomic analysis of the bile stress response in probiotic Lactobacillus salivarius LI01. Journal of Proteomics. doi.org/10.1016/j.jprot.2016.08.021
5.Lv LX, et al.(2016) Integrated transcriptomic and proteomic analysis of the bile stress response in probiotic Lactobacillus salivarius LI01. Journal of Proteomics. doi.org/10.1016/j.jprot.2016.08.021
6.Wang C, Liu C, Wei L, Shi L, Pan Z, Mao L, Wan X, Ping Z, Jiang T, Chen Z. (2016) A Group of Novel Serum Diagnostic Biomarkers for Multidrug-Resistant Tuberculosis by iTRAQ-2D LC-MS/MS and Solexa Sequencing. International Journal of Biological Sciences 12(2), 246-256.
7.Cui Y, et al. (2016) Transcriptomic/proteomic identification of allergens in the mite Tyrophagus putrescentiae. Allergy.DOI:10.1111/all.12999
8.Cao JY, et al. (2016) TMT-based quantitative proteomics analyses reveal novel defense mechanisms of B
Q1：iTRAQ能否鑒定新蛋白？
A：iTRAQ不能鑒定新蛋白，只能做定量。定量的基本原理是根據(jù)肽段上報告基團信號的強弱來計算，不涉及內(nèi)參蛋白。同時，不能做未知蛋白鑒定。iTRAQ產(chǎn)品的分析都是基于對數(shù)據(jù)庫的篩查，所以必須是序列已知的蛋白才可以檢測到。
Q2：iTRAQ蛋白定量能鑒定多少個蛋白，為什么有些物種鑒定到蛋白那么少？
A：對于可鑒定蛋白的數(shù)量確實因物種有差異，原因是鑒定蛋白是通過篩查蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫來進行的，如果某個物種沒有很好的基因組注釋信息或轉(zhuǎn)錄組注釋信息，篩查得到的信息也會很少。尤其是植物類、昆蟲類、水產(chǎn)品類非模式物種，往往只能鑒定不到1k個蛋白。
Q3：蛋白鑒定是不是一定要依賴于數(shù)據(jù)庫？
A：是的，所有蛋白產(chǎn)品里的蛋白鑒定，都是需要依賴數(shù)據(jù)庫的。數(shù)據(jù)庫信息的完整性，將對蛋白鑒定的結(jié)果產(chǎn)生一定影響。
Q4：iTRAQ結(jié)果的后期驗證？
A：一般選擇注釋結(jié)果與所關(guān)注的生物過程緊密相關(guān)的蛋白或者差異顯著的蛋白來做后期驗證。iTRAQ的后期驗證，通常采用western blot。而植物中，可用抗體較少，通常的處理方式是不驗證或是自行制備多抗進行驗證；亦可進行mRNA的定量qPCR驗證，找mRNA和蛋白的關(guān)聯(lián)。兩種方式都已有文章發(fā)表。
轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析益生菌唾液乳桿菌LI01的膽汁應(yīng)激反應(yīng)
研究背景
最近發(fā)現(xiàn)幾種唾液乳桿菌菌株，表現(xiàn)出良好的益生菌性質(zhì)，如抗菌活性，炎癥調(diào)節(jié)，甚至是腫瘤性病變減少等。從健康人體內(nèi)分離的唾液乳桿菌LI01已經(jīng)在預(yù)防和治療肝衰竭中表現(xiàn)出了益生菌性質(zhì)。對膽汁的耐受對于乳桿菌在胃腸道中的存活和發(fā)揮其益處至關(guān)重要。
研究結(jié)果
通過轉(zhuǎn)錄組測序和iTRAQ蛋白質(zhì)組定量分析后發(fā)現(xiàn)，與空白對照相比，添加ox膽汁溶液培養(yǎng)的LI01菌株中檢測到591個差異表達的基因和347個差異表達的蛋白質(zhì)。利用GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)差異表達的基因主要參與脅迫應(yīng)答，糖酵解和轉(zhuǎn)運以及諸如碳水化合物代謝和氨基酸生物合成等途徑；差異表達的蛋白質(zhì)主要參與DNA修飾、基因表達和細胞組分降解和代謝過程的調(diào)節(jié)。
圖 差異表達基因及差異表達蛋白質(zhì)的KEGG富集分析
研究還發(fā)現(xiàn)，LI01的膽汁耐受能力是基于高度重塑的細胞包膜以及增強的膽汁外排系統(tǒng)，而不是基于膽鹽水解酶的活性。一些差異表達的基因是與調(diào)節(jié)系統(tǒng)即應(yīng)激反應(yīng)和中樞代謝過程相關(guān)的基因，也在膽汁誘導(dǎo)的損傷預(yù)防和能量效率中起作用。此外，膽汁鹽似乎增強了LI01的蛋白水解和氨基酸攝?。ㄌ貏e是芳香族氨基酸）能力，這個結(jié)果表明該菌株具有肝保護的性質(zhì)。
總而言之，本研究的開展建立了唾液乳桿菌LI01中膽汁應(yīng)激的全局反應(yīng)機制的模型。
參考文獻
Lv LX, et al.(2016) Integrated transcriptomic and proteomic analysis of the bile stress response in probiotic Lactobacillus salivarius LI01.Journal of Proteomics. doi.org/10.1016/j.jprot.2016.08.021
KEGG注釋根據(jù)KEGG注釋總表，可以對注釋到KEGG的差異蛋白總體情況進行Unigene數(shù)目的統(tǒng)計。
KOG/COG注釋COG（Clusters of Orthologous Groups of proteins），即同源蛋白簇。一般原核 生物用COG，真核生物用KOG。COG注釋作用：1. 通過已知蛋白對未知序列進行功能注釋；2. 通過查看指定的COG編號對應(yīng)的protein數(shù)目，存在及缺失，從而能推導(dǎo)特定的代謝途徑是否存在； 3. 每個COG編號是一類蛋白，將query序列和比對上的COG編號的proteins 進行多序列比對，能確定保守位點，分析其進化關(guān)系。
GO富集分析GO分為三個功能：生物進程（biological process） 細胞組成（cellular component）分子功能（molecular function）。一般進行分析時，會 取前50個差異較為明顯的蛋白繪制GO注釋圖。分別對應(yīng)這三個功能的差 異蛋白數(shù)量為25個，15個以及10個。
蛋白質(zhì)network網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建蛋白與蛋白的互作關(guān)系一般用String軟件繪制，String可以用來查找蛋白間的作用關(guān)系及作用強度，同時也可以查看單個蛋白與其他相關(guān)聯(lián)的上下游關(guān)系，可以為老師研究蛋白互作關(guān)系提供思路 。
