背景簡介
數(shù)據(jù)非依賴性的掃描模式(Data-independent acquisition, DIA)是近幾年來發(fā)展的一種新的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集方式?？梢詫μ囟ㄙ|(zhì)量范圍內(nèi)的所有母離子進行碎裂，采集所有母離子的碎片離子信息進行蛋白定性和定量。目前流行的蛋白質(zhì)組學研究手段，如iTRAQ\TMT、 Label-free、SILAC采用的都是數(shù)據(jù)依賴性的掃描模式(Data-dependent acquisition, DDA)。相對于DDA， DIA 具有更好的準確性和可重復性，是蛋白質(zhì)組學研究的一大重要趨勢。下圖為 DIA 定量技術(shù)原理圖：
技術(shù)優(yōu)勢
靈敏度高，無歧視地獲得所有肽段的信息，不會造成低豐度蛋白信息的丟失 循環(huán)時間固定，掃描點數(shù)均勻，定量準確度高 重復性好，重復樣品間的定量相關(guān)性可達到0.99以上。
技術(shù)路線
分析內(nèi)容
樣本類型
蛋白質(zhì)溶液，組織樣品、細胞及體液樣品（具體送樣量請咨詢各駐地項目經(jīng)理）
代表性文章
Collins B C , Hunter C L , Liu Y , et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry[J]. Nature Communications, 2017, 8(1):291.Rouwette T , Sondermann J , Avenali L , et al. Standardized profiling of the membrane-enriched proteome of mouse dorsal root ganglia provides novel insights into chronic pain[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2016, 15(6):mcp.M116.058966.
Q1：蛋白質(zhì)定量DIA和傳統(tǒng)的非標記定量有何優(yōu)勢
A：傳統(tǒng)的非標記定量一般需要通過分級的方法開展，耗時久、重復性差、數(shù)據(jù)結(jié)果可信度不高；蛋白定量DIA技術(shù)是新一代非標記定量技術(shù)，可通過更優(yōu)的數(shù)據(jù)采集模式，在相同時間采集到更豐富的信息，壓縮周期的同時，大福度提高樣本間平行比較的重復性，數(shù)據(jù)結(jié)果可信度極高。
蛋白質(zhì)定量DIA用于慢性疼痛的研究
Standardized Profiling of The Membrane-Enriched Proteome of Mouse Dorsal Root Ganglia (DRG) Provides Novel Insights Into Chronic Pain. Molecular & Cellular Proteomics. 2016.
研究背景
慢性疼痛是一種治療方案有限的復雜疾病。雖對其發(fā)病機理進行了多次研究，但各結(jié)果間存在較大不一致性，主要受限于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組shotgun技術(shù)固有的缺陷。發(fā)病機制依然不清晰。
研究結(jié)果
大量數(shù)據(jù)表明CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、EpCAM等表面標志物可以定義CSC，研究人員選擇CD24、CD133、EpCAM分選HuH1和HuH7不同細胞亞群，用于研究CSC生物學和分子水平異質(zhì)性。免疫熒光染色表明，在兩種細胞培養(yǎng)形態(tài)下（單層培養(yǎng)、球體培養(yǎng)）,兩個HCC細胞系均表現(xiàn)出明顯的細胞異質(zhì)性。
實驗設計
炎癥性疼痛和神經(jīng)性疼痛兩種模型鼠及其對應control鼠共4組，各3個生物學重復
每個生物學重復由10-13只鼠pooling而成
解剖獲得同側(cè)背根神經(jīng)節(jié)膜部分提取蛋白進行DIA蛋白定量
圖 實驗設計類型
主要發(fā)現(xiàn)
1）DDA建庫鑒定到3067個蛋白，迄今鑒定數(shù)最多的背根神經(jīng)節(jié)蛋白研究。
2）DIA四組都鑒定到的蛋白有2526個，其中CFA和Vehicle都鑒定到的有2581個；SNI和Sham都鑒定到的2600個，表明實驗重復性較好。
3）炎癥性和神經(jīng)性疼痛差異蛋白分別為64和77，兩種模式共有差異蛋白為12個。
4）其中Serca蛋白在兩種模式小鼠中表達量變化相反，表明兩種疼痛的調(diào)控機制不同。
5）western blot和免疫組化對上述DIA結(jié)果進行了驗證
圖 四組實驗模型的蛋白聚類分析
參考文獻Rouwette T , Sondermann J , Avenali L , et al. Standardized profiling of the membrane-enriched proteome of mouse dorsal root ganglia provides novel insights into chronic pain[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2016, 15(6):mcp.M116.058966
結(jié)構(gòu)域注釋柱狀圖Interproscan是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和功能注釋最常用的軟件之一。為了能更全面的進行結(jié)構(gòu)域的注釋，Interproscan整合了一些最常用的結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫，包括 Pfam、ProDom、 SMART 等結(jié)構(gòu)域的數(shù)據(jù)庫，利用模式結(jié)構(gòu)或特征進行功能未知蛋白的結(jié)構(gòu)域注釋，繪制結(jié)構(gòu)域注釋的柱狀圖。橫坐標代表蛋白數(shù)目，縱坐標代表注釋到的 IPR 條目。
蛋白表達水平聚類圖
蛋白表達水平聚類分析用于判斷不同實驗條件下蛋白表達量的相關(guān)性。每個樣品都會得到一個絕對或相對蛋白表達集合，將所有樣品表達集合并在一起，用于層次聚類分析和 K-means 聚類分析。
KEGG 富集通路圖在 KEGG 通路圖中，圈出了差異蛋白， 其中綠底色框內(nèi)為鑒定出的總蛋白， 藍色框標記的是下調(diào)差異蛋白，紅色 框標記的是上調(diào)差異蛋白，黃色框標 記的是通路中該功能對應的多個蛋白中既有上調(diào)差異蛋白、也有下調(diào)差異 蛋白。
差異蛋白互作分析利用 StringDB 蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫進行 鑒定蛋白的互作分析，若在數(shù) 據(jù)庫中有相應的物種，則直接提取相應物種的序 列，若無，則提取近 源物種的序列，然 后將差異蛋白的序列與提取出的序列進 行 blast 比 對，得出相應的互作信息，構(gòu)建網(wǎng)絡圖。
